做完ATAC-seq、ChIP-seq、CUT&Tag或DAP-seq后，报告里常常会出现成千上万个peak。一开始看结果会很兴奋，这里有peak，那里也有peak，启动子有peak，远端区域也有peak，差异peak 一大堆，motif 结果也列出了一串候选转录因子。但真正写文章、补机制、设计验证实验时这么多peak，不可能每一个都做ChIP-qPCR、双荧光、EMSA或功能验证。那问题就来了。验证资源就那么多，一次ChIP-qPCR能跑的位点有限，下游想接的功能实验更是烧钱烧时间。怎么从这几万个里头，挑出真正值得你押注的那十来个？peak出来之后该用什么逻辑把它们一层层筛下去。

一、不同技术里的peak代表什么含义

不同技术的peak，能说明的问题不同。

二、别急着挑基因，先确认数据质量是否可以用

这一步最容易被跳过，但它决定了后面所有工作是不是白做。在动peak之前，先把整体数据质量过一遍，确认信号是真的。

（1）测序质量和比对率。这是地基，比对率太低、重复率异常高的数据，后面的peak本身就不可信。

（2）样本间相关性。 重复样本之间相关性一般都不错，如果两个生物学重复差异很大，说明哪个环节可能有问题，先别急着分析数据。

（3）peak在基因组功能区的分布。 重点看promoter-TSS区域有没有合理占比。转录因子和很多组蛋白修饰的核心调控功能就发生在TSS附近，如果你做的是TF，promoter区却几乎没有富集，那要警惕抗体特异性或者结合模式的问题。

（4）peak在TSS上下游的分布。 把IP的reads信号沿TSS上下游画出来，正常情况下应该在TSS附近形成明显富集峰。这条曲线漂不漂亮，基本能一眼判断这批数据值不值得深挖。

图 TSS附近reads富集情况示意图。正常情况下，优质ChIP-seq/ATAC-seq数据应在TSS附近形成明显富集峰。

（5）FRiP 值。 落在peak内的reads占总reads的比例，反映信噪比。经验上5%以上算可以接受，这条不达标，假阳性会非常多。

（6）peak 数目是否符合预期。 转录因子通常会有上千个结合位点（经验上T 大于1000个peak 比较正常），组蛋白修饰则看修饰类型。数目过少要怀疑富集失败，过多要怀疑背景太高。

（7）重叠peak占比。 重复样本之间，重叠peak占比50%以上，说明结果的可重复性是过关的。

这一步走完，你心里应该有底了：这批数据能不能信，值不值得往下挑。

三、motif分析——这是TF数据最需要关注的一张表

如果你做的是转录因子，这一步的重要性怎么强调都不过分。它能直接告诉你：你拉下来的，到底是不是你想要的那个蛋白。打开HOMER的Known Motif富集结果，重点看这几部分内容：

（1）排在最前面的motif是不是你的目的蛋白，或者同一家族。 软件会把富集到的known motif按显著性（P-value）从高到低排好。如果排名第一的motif匹配到的正是你研究的TF，或者它所属的转录因子家族，那这批数据的可信度直接拉满。如果完全对不上那就要继续关注一下其他质控指标。

（2）一般第一个motif 要明显比第二个更显著。 一个干净、特异的 ChIP 数据，头号motif的显著程度应该和后面的拉开差距。如果前几个motif显著性差不多、谁也不突出，可能结合特异性可能不够。

（3）避开假motif。 碱基复杂度低、只有两个碱基反复重复那种（比如 GAGAGA、CTCTCT），通常不是真正有意义的结合基序，不建议优先考虑。优先挑序列复杂、信息量高的motif。

motif 这一关过了，你才有底气说后面挑出来的peak是真的。

图 JASPAR数据库中转录因子结合Motif示意图。

四、开始真正缩圈——把几万压到几十

确认数据可信之后，正式收紧范围。这一步有六个步骤参考，可以叠加使用，每叠一层，范围就小一圈：

（1）重复样本取交集。 只保留在所有生物学重复里都稳定出现的peak。靠运气出现一次的噪音，在这一步就被砍掉了。这是性价比最高的一刀。

（2）顺着最可信的motif反查peak。 在motif分析里锁定了那个最可信的motif之后，把包含这个motif的peak单独提出来做后续分析。带着明确结合基序的peak，本身就是质量最硬的一批。

（3）只看promoter区。 把分析范围收到启动子区域。落在promoter的结合位点，最有可能直接调控下游基因转录，功能解释最清晰，验证实验也最好设计。这是最容易出故事的一类。

图 Peak在基因组不同功能区域的分布示意图。

（4）提高阈值，只留信号强的peak。 这一步直接卡数值，几个核心列：

——fold enrichment（富集倍数）： 这是最关键的排序指标。富集倍数越高，结合越真实可信。

——-log10（p-value）： 反映统计显著性。

——-log10（q-value）： q值是对p值做多重检验校正后的结果，更严格。

——pileup / abs_summit： pileup反映该位点堆叠的reads数，abs_summit是信号最高点的位置。

把这几列一卡，几千个peak通常能压到几十个又强又显著的核心位点。

（5）做GO / KEGG，锁定关键调控。 把筛出来的peak关联的靶基因拿去做功能富集。看看显著命中的通路里，有没有正好是你课题关心的方向（比如逆境响应、激素信号、发育调控）。命中你关心通路的那些靶基因，就是你的重点验证对象。这一步等于让数据自己告诉你哪些基因最值得做。

图 GO富集分析示意图，通过功能富集快速定位与研究主题相关的关键通路。

（6）与转录组联合分析（下一节单独讲）。

五、和转录组联合——给你的候选位点上双保险

这是临门一脚，也是审稿人最认的一招。ChIP-seq等技术有个天然的局限：它鉴定的是TF在体外/体内结合了哪些DNA区域，但结合不等于有功能。有些结合可能发生在非活性染色质区，有些可能被其他因子抑制而压根没启动转录。转录组（RNA-seq）正好补上这一块：它告诉你这些基因的表达水平到底变没变。大致逻辑是：

（1）ChIP-seq给你转录因子的直接结合位点 → 潜在靶基因

（2）RNA-seq给你差异表达基因（DEGs）

（3）两个清单取交集

如果一个基因，既被TF结合（ChIP有peak），它的表达又确实随处理发生了显著变化（RNA-seq 是DEG），那就基本能确认这个TF的结合是有真实功能意义的。

取完交集，关键调控基因的范围一下就锁定了。排在最顶上、证据最齐的那些，就是你最该投入实验去验证的对象。

六、挑出最终候选，直接对接实验

筛到这里，假设你已经有了一两个非常感兴趣的基因。最后一步是把它和具体的motif序列对应上，为下游实验做准备。

不同peak对应的验证方式不一样。

如果经费有限，可以先验证2–5个最高优先级 peak，不建议一开始铺太多。比较常见的验证组合是：

组合 1：ATAC-seq + RNA-seq后筛关键peak

差异开放peak
↓
关联差异表达基因
↓
motif找候选TF
↓
ChIP-qPCR/双荧光验证
↓
构建TF—开放区域—靶基因调控模型

组合 2：DAP-seq + RNA-seq后筛靶基因

DAP-seq peak
↓
启动子区域靶基因注释
↓
与RNA-seq差异基因取交集
↓
筛关键通路基因
↓
DAP-qPCR/EMSA/双荧光验证
↓
构建TF—靶基因—表型模型

组合 3：H3K27ac CUT&Tag/ChIP-seq + RNA-seq后筛增强子

差异H3K27ac peak
↓
关联差异表达基因
↓
结合ATAC-seq判断开放性
↓
筛候选增强子区域
↓
报告实验或ChIP-qPCR验证
↓
解释关键基因表达激活机制