引言

对于组学分析来说，常常会寻找组间的差异，例如差异基因（转录组）、差异菌（宏基因组）以及差异通路（宏基因组），而转录组分析上最为经典的DESeq2包对于以上分析也都适用
DESeq最早在2010年发表在Genome Biology上，2014年上更新版本DESeq2。DESeq2是基于负二项广义线性模型估算样本间基因差异表达概率，既适于有生物学重复的也适于没有生物学重复的样本，同时除了在转录组学，在宏基因组上使用DESeq2计算差异菌的也有报道

安装并导入DESeq2包

DESeq2包目前需要依赖BiocManager包，该包用于管理bioconductor项目中的所有包，因此首先安装该包

# 1.判断是否有BiocManager包，若不存在则安装
options(repos=structure(c(CRAN="https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/CRAN/"))) #设置清华镜像，加速下载

if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
  install.packages("BiocManager")
if (!requireNamespace("DESeq2", quietly = TRUE))
  BiocManager::install('DESeq2')  #通过BiocManager安装DESeq2 
library(DESeq2) #加载library

由于DESeq2包较大，安装时间较长，当导入后没有任何报错即为安装成功

数据要求

• 1.基因表达矩阵
  行为基因，列为样本，需要注意表达数据为原始reads count，DESeq2内部会根据样本大小对counts进行调整，自带标准化过程，不要使用标准化后的FPKM或TPM
  
• 2.样本分组信息
  样品信息，第一列是样品名称，第二列是样品的处理情况（对照还是处理等），即condition，condition的类型是一个factor，第三列可添加其他信息（可选）。需要自己根据临床/实验分组信息单独建立
  

制作dds对象，进行差异分析

想要进行差异分析，首先需要生成DESeq2必须的数据类型，即dds类型数据，DESeq2包使用DESeqDataSet(dds)作为存放count数据及分析结果的对象，每个DESeqDataSet(dds)对象都必须由以下三者：

• countData，存放counts matrix的对象
• colData，存放分组信息和处理信息的对象
• design公式，对应sample的分组信息，需要以~ 波浪字符进行连接，而不同的信息之间需要以+连接，示例:design=~variable_1 + variable_2
  这些分组信息会被用来估算离散度和估算Log2 fold change的模型
  注意，为了方便起见，在默认参数下，用户应该把感兴趣的分组信息放在formula的最后，并且确认control组的level是第一个（因子的level，见R语言基础视频）

## 制作dds对象，构建差异基因分析所需的数据格式
dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = B, colData = coldata, design = ~ condition);

# countData = B，readscount矩阵
# colData = coldata,分组信息，根据这个才能在两组之间比较
# design = ~ condition，公式，表示按照condition进行分析

## 5.差异分析结果
dds <- DESeq(dds)	#正式进行差异分析

dds对象包含的内容：

详细差异分析步骤：

estimating size factors：估算库size factor
estimating dispersions：估算离散度
gene-wise dispersion estimates：估算基因的离散度
mean-dispersion relationship：均值-离散度关系
final dispersion estimates：估算最终离散度
fitting model and testing：模型适应和测试

差异分析完成后，使用results从DESeq分析中提取出一个结果表，从而给出样品的基本均值，log2倍变化，标准误差，测试统计量，p值和校整后的p值

筛选差异基因

一般按照pvalue < 0.05 & |log2FoldChange| >1筛选差异基因，如果想要结果更可靠，可选择使用更严谨的padj和更大的log2FoldChange进行筛选
最后可分别保存差异上调和差异下调的基因：

filter_up <- subset(res, pvalue < 0.05 & log2FoldChange > 1) #过滤上调基因
filter_down <- subset(res, pvalue < 0.05 & log2FoldChange < -1) #过滤下调基因

得到差异基因之后，可进行基因功能富集、PCA和热图聚类等后续分析

完整代码

# <差异基因分析>
# 1.判断是否有BiocManager包，若不存在则安装
options(repos=structure(c(CRAN="https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/CRAN/"))) #设置清华镜像，加速下载

if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
  install.packages("BiocManager")
if (!requireNamespace("DESeq2", quietly = TRUE))
  BiocManager::install('DESeq2')  #通过BiocManager安装DESeq2 
library(DESeq2) #加载library

setwd("C:/Users/yut/Desktop/data") #设置工作目录，所有输出文件保存于此

#输入数据要求
# DEseq2要求输入数据是由整数组成的矩阵
# DESeq2要求矩阵是没有标准化的

##2.读入所有基因原始readscount表达矩阵，行为基因，列为样品
A <- read.table("control_case_readscount.txt", header = T, row.names = 1)
B <- as.matrix(A) #转换成矩阵格式，保证都是数值

View(B)
## 3.实验分组
# 样品信息矩阵即上述代码中的colData，它的类型是一个dataframe（数据框），
# 第一列是样品名称，第二列是样品的处理情况（对照还是处理等），即condition
coldata <- read.table("sample_info.txt",header = T,row.names = 1)
coldata <- coldata[, c("condition", "type")]
View(coldata)	#查看分组信息

## 4.制作dds对象，构建差异基因分析所需的数据格式
dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = B, colData = coldata, design = ~ condition);

# countData = B，readscount矩阵
# colData = coldata,分组信息，根据这个才能在2组之间比较
# design = ~ condition，公式，表示按照condition进行分析

## 5.差异分析结果
dds <- DESeq(dds)	#正式进行差异分析

## 6.提取结果，在treated和untreated组进行比较
res <- results(dds, contrast = c("condition", "treated", "untreated")) 
# results从DESeq分析中提取出一个结果表，从而给出样品的基本均值，log2倍变化，标准误差，测试统计量，p值和校整后的p值； 
resordered <- res[order(res$padj),]	 #按照padj从小到大排序
sum(res$padj < 0.05, na.rm = TRUE)	#统计padj小于0.05显著差异的基因

## 7.输出图片
plotMA(res)	#画火山图，横轴是标准化后的平均readscount，纵轴是差异倍数，大于0是上调，小于0是下调,红色点表示显著差异的基因

plotMA(res, alpha = 0.05, colSig = 'red', colLine = 'skyblue')
# alpha:p-value
# colSig:显著性基因的颜色
# colLine:y=0的水平线

##8.过滤上调、下调基因
filter_up <- subset(res, pvalue < 0.05 & log2FoldChange > 1) #过滤上调基因
filter_down <- subset(res, pvalue < 0.05 & log2FoldChange < -1) #过滤下调基因
print(paste('差异上调基因数量: ', nrow(filter_up)))  #打印上调基因数量
print(paste('差异下调基因数量: ', nrow(filter_down)))  #打印下调基因数量

##9.保存到文件
write.table(as.data.frame(resordered), file = "./differential_gene.txt") #log2FoldChange + pvalue + padj
write.table(filter_up, file="./filter_up_gene.txt", quote = F)  
write.table(filter_up, file="./filter_down_gene.txt", quote = F)

• MA-plot （M-versus-A plot）
  MA图对数据分布情况的可视化。该图将数据转换为M（对数比）和 A（平均值），然后绘制这些值来可视化两个样本中测量值之间的差异。
  

其他问题

• Error in checkSlotAssignment

> ## 6.提取结果，在treated和untreated组进行比较
> res <- results(dds, contrast = c("condition", "treated", "untreated")) 
Error in checkSlotAssignment(object, name, value) : 
  assignment of an object of class “DFrame” is not valid for slot ‘elementMetadata’ in an object of class “DESeqResults”; is(value, "DataTable_OR_NULL") is not TRUE

解决方法：
尝试使用.libPaths()查看DESeq2的位置，并找到删除，再重新运行安装命令，Update选择all.