山羊胃肠道多界微生物组

The multi-kingdom microbiome of the goat gastrointestinal tract

Research Article，2023-10-2，Microbiome，[IF 15.5]

DOI：https://doi.org/10.1186/s40168-023-01651-6

原文链接：https://microbiomejournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s40168-023-01651-6

第一作者：Yanhong Cao^1,2*, Tong Feng^3,4*†, Yingjian Wu^3*

通讯作者：Wei-Hua Chen ^3,9†, Qingyou Liu^1,4†

主要单位：

1 Guangdong Provincial Key Laboratory of Animal Molecular Design and Precise Breeding, School of Life Science and Engineering, Foshan University, Foshan, 528225, China.

2 Guangxi Vocational University of Agriculture, Nanning 530007, Guangxi, China

3 Key Laboratory of Molecular Biophysics of the Ministry of Education, Hubei Key Laboratory of Bioinformatics and Molecular-imaging, Center for Artificial Biology, Department of Bioinformatics and Systems Biology, College of Life Science and Technology, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430074, Hubei, China

4 State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-Bioresources, Guangxi University, Nanning 530005, China

* Contributed equally to this work;

† Correspondence should be addressed to Qingyou Liu (qyliu-gene@gxu.edu.cn), Wei-Hua Chen (weihuachen@hust.edu.cn) and Tong Feng (tong.feng@hotmail.com).

- 摘要 -

背景：山羊是全球重要的家畜之一，通过提供肉类、奶制品和皮毛，在人类生活中发挥着不可或缺的作用。尽管近年来微生物组研究取得了显著进展，但仍缺乏涵盖山羊微生物组的全面研究，包括不同消化道部位（GIT）、发育阶段、饲养方式和地理因素等。在本研究中，我们采集了来自山羊GIT十个不同部位的497个样本，获得约3TB的原始序列数据，对其微生物群落分布进行了系统的研究。

结果：论文构建了山羊肠道微生物组目录（GMMC），其中包括了4,004个细菌基因组、71个古细菌基因组以及7,204个病毒基因组，并注释了超过4,817,256个非冗余蛋白编码基因。论文还揭示了在山羊GIT部位的微生物群落动态中，存在着与饲养方式相关的模式，这可能与山羊消化和吸收食物的能力、疾病风险以及肠段功能有关，在大肠部位鉴定出丰富的植物纤维消化微生物菌属。我们量化了不同因素对甲烷产生微生物分布和丰度的影响，包括GIT部位、年龄、饲养方式和地理位置，并通过综合的病毒-细菌/古细菌相互作用网络，鉴定了68种针对甲烷产生影响的宏病毒。

结论：综上所述，我们的山羊肠道微生物基因组目录通过微生物组-宿主相互作用提供了山羊肠道微生物群落的功能参考蓝图，并为微生物干预提供了途径，以实现更好的山羊营养改善、饲养效率和降低甲烷饲养模式优化奠定了基础。

- 引言 -

山羊是世界范围内具有重要经济价值的家畜动物，通过提供肉类、奶制品和皮毛等产品，在人类生活中发挥着不可或缺的作用。据联合国粮食及农业组织（FAO）的数据，全球约有1,000个山羊品种和超过10亿只山羊，其中中国是世界上山羊数量最多的国家之一，约有1.4亿只山羊。

反刍动物的胃肠道微生态群落在其宿主的生理功能中具有重要作用；例如，青草、干草、玉米和青贮料等饲料可以首先被瘤胃微生物群分解，然后被宿主动物利用。之前的研究中主要关注木质纤维素的分解及其与瘤胃微生物群的关系，但近期的研究表明，胃肠道微生物群对整体食物消化和营养吸收也有显著影响。我们在水牛方面的研究发现，纤维素分解微生物在水牛胃肠道消化过程中发生了变化。因此，可以想象在不同的胃肠道部位，微生物组成不同，且常与后者的功能相关。此外，除了胃肠道部位，其他因素也对宿主微生物组的构成产生重要影响，包括年龄、饲养方式、地理位置和宿主物种等因素。

近年来，通过重构宏基因组装（MAGs）来获得微生物基因组已被应用于猪、鸡、小鼠、牛、水牛、反刍动物和人类的微生物组研究，为研究人员提供了探索未知微生物群的机会，揭示了微生物生态与感兴趣的胃肠道部位之间的功能相互作用。但尚缺乏对所有山羊胃肠道部位进行系统探索的研究，尤其是使用大量的涵盖多种影响因素的山羊肠道样本的全面研究。

在本研究中，我们对来自不同胃肠道部位、不同年龄、不同饲养方式和不同地理位置的268只山羊的497个样本进行了全面的微生物生态结构调查。我们对这些样本进行了微生物基因组测序，生成了约3TB的原始序列数据。我们构建了包含4,075个细菌和古细菌基因组装（MAGs）以及7,204个病毒基因组的山羊微生物基因组目录（GMMC），并注释了4,817,256个非冗余蛋白编码基因。我们发现，在与公共基因组数据库进行比较时，43.71%的MAGs（n = 1,781）和90.91%的病毒基因组（n = 6,549）在平均核苷酸同源性（ANI）阈值为95%下均为新颖的，此外，20.70%的非冗余蛋白质（n = 997,417）序列在公共蛋白质数据库（eggNOG和CAZyme数据库）中没有同源物，表明我们的数据集具有创新性。通过比较宏基因组分析，我们确定了已知和新的微生物与山羊胃肠道部位之间的关联，并探讨了环境和宿主因素对微生物多样性的贡献。我们构建了较为全面的病毒-细菌/古细菌相互作用网络，并鉴定出68种可能参与甲烷产生的病毒。通过这些工作，我们填补了山羊肠道微生物研究中的空白，提供了涵盖细菌、古细菌和病毒基因组和编码蛋白的目录。我们相信，这些结果和资源将有助于进一步研究山羊及相关反刍动物微生物群对功能或表型的影响，为实现更好的山羊生产和改善生态环境质量奠定基础。

- 结果 -

山羊肠道微生物基因组目录（GMMC）的构建

Construction of the goat multi-kingdom microbiome catalog (GMMC)

为了全面进行山羊胃肠道微生物研究，我们共采集了497个样本（见表S1），来自十个山羊胃肠道位点，其中包括来自三个部分的9个胃肠道位点的259个内容样本，即胃（瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃）、小肠（十二指肠、空肠、回肠）和大肠（盲肠、结肠；见表S2），以及跨越三个发育阶段（1月龄、6月龄和12月龄；见表S3）、两种喂养方式（圈养和放养；见表S4）和四个地理位置（中国的云南、四川、广西和海南省；见表S5）的238个直肠粪便样本。我们评估了肠段位置的细菌数量分别为胃、小肠和大肠的10⁷~10⁹/g、10⁶~10⁷/g和10⁷~10⁹/g（图1a）。

在质控后，我们总共获得了2.7 Tb的cleandata，平均每个样本有36,730,204个reads和5,485,416,272个碱基（见表S6）。通过组装和分bins，获得了42,710个bin（MAGs）。然后，我们在ANI≥99%的条件下进行去冗余，过滤掉了完整度≤80%或污染度≥10%的MAGs，最终获得了共计4,075个长度超过200kb的MAGs。我们使用GTDB-Tk对它们进行了物种注释，并鉴定出了共计4004个细菌MAGs和71个古细菌MAGs（见表S7）。其中，约47%的MAGs按照Bowers等人的标准鉴定为高质量，完整度>90%，污染<5%（图1c），并且有9个MAGs的完整度达到100%（见表S7）。97.89%的MAGs包含多个tRNA基因（tRNA类型数>=10，见表S7），每个MAGs包含约15.9个tRNA类型。然而，只有83个MAGs包含一个或多个全长16S rRNA基因（见表S7），而276个MAGs编码部分16S rRNA基因，可能是因为短读取组装无法组装这些高度相似的区域。总体而言，这4075个MAGs的平均大小为2.17Mb（0.61 Mb ~ 7.13 Mb；见表S7），平均N50长度（图1d）为43.97Kb（4.30Kb ~ 1.04Mb；见表S7）；它们编码了494到5,897个蛋白质编码基因，平均为1,802个（见表S7）。此外，我们还使用类似于Luis等人的生物信息学流程对共计12,355个疑似病毒contigs（主要是噬菌体）进行了注释，并将它们在ANI为95%的条件下去重为7,204个非冗余病毒基因组，最小长度为5kb。其中，18.86%的基因组在完整度>90%的标准下为高质量（根据CheckV工具）。有趣的是，我们没有使用类似于Paul等人的方法鉴定到任何真核基因组，这表明在我们的样本中，真核基因组可能非常罕见，或者我们的方法没有针对这些基因组进行优化。稀疏性分析结果表明，我们已经收集了足够的样本来恢复山羊胃肠道细菌和古细菌基因组，正如图1b和图S5b所示，非冗余细菌、古细菌和病毒基因组的数量在约100个样本附近趋于稳定。综上所述，我们将这4,004个细菌MAGs和71个古细菌MAGs以及7,204个病毒基因组称为山羊多界微生物组目录（GMMC）。

为了检查GMMC基因组是否能够提高山羊胃肠道微生物基因组的覆盖率，我们进行了比对率的统计，并发现81.8%的读序(read)可以映射到GMMC基因组，其中80.5%和12.8%可以映射到细菌/古细菌MAGs和病毒基因组（图1e）。总体读序映射率明显高于大多数公共微生物基因组数据库，包括反刍动物胃肠道、山羊粪便、牛瘤胃、猪肠道、人类肠道、鸡肠道以及来自NCBI数据库的细菌、真菌、古细菌和原生动物参考基因组的综合数据集（BFAP，详见方法；图1g）。

然后，我们通过将GMMC基因组与上述公共数据集中的序列进行比较，并使用GTDB-Tk进行注释，分析了GMMC基因组的新颖性。在95%和99%的ANI阈值下，GMMC细菌/古细菌MAGs的43.71%（n = 1,781）和87.21%（n = 3,554）是新颖的，即它们与任何公共数据库中的序列（包括GTDB和图1g中使用的序列）在核苷酸同源性阈值上都没有高于这些阈值的核苷酸身份（此外，在相同的ANI阈值下，与Gut Virome Database（GVD）、Metagenomic Gut Virus（MGV）、Gut Phage Database（GPD）和NCBI病毒参考基因组，Release 201（见图S2a）等多个公共病毒数据库中，有90.91%（n = 6,549）和96.23%（n = 6,933）的病毒基因组是新颖的）。

总的来说，我们组装了一个包括4,004个细菌MAGs和71个古细菌MAGs以及7,204个病毒基因组的GMMC目录，给出了更好地代表山羊胃肠道微生物群落的基因组/非冗余蛋白的序列参考蓝图，同时包含了相当比例的新颖基因组作为待发掘的方向。

图1 山羊胃肠道微生物基因组的构建

a 山羊胃肠道样本采集。图中显示了山羊的示意图，突出显示了其胃肠道沿着胃肠道的箭头表示食物的流动方向。GIT位点旁边括号中的数字表示本研究获取的样本数量。本研究将GIT位点分为四个部分，即胃（瘤胃、网胃、瓣胃和皱胃）、小肠（十二指肠、空肠和回肠）、大肠（盲肠和结肠）以及直肠（粪便样本）。部位名称旁边的数字表示其微生物数量的估计值。

b细菌/古细菌MAGs和病毒基因组（Y轴）随测序样本数量（X轴）的变化的稀疏性分析。细菌、古细菌和病毒基因组的稀疏性曲线分别用蓝色、绿色和红色表示（方法）。

c GMMC中基因组的组成和质量，包括4,004个细菌MAGs、71个古细菌MAGs和7,204个病毒基因组。对于GMMC，质量标准根据Bowers等人定义方法确定；完整：根据CheckM，完整度≥90%，污染度≤5%，至少18个tRNA；高质量：完整度≥90%，污染度≤5%；中等质量：完整度≥80%，污染度≤10%；低质量：质量分数≥50。对于病毒基因组，使用CheckV进行质量评估。

d GMMC的Contig N50和N90长度。

e Cleandata映射到GMMC的比例。使用Wilcoxon Rank Sum test显示不同组之间的统计学显著性；*** 表示 P < 0.001。

f 在95%和99%平均核苷酸同源性（ANI）水平下，与公共数据集相比，GMMC中新颖细菌和古细菌MAGs的百分比（方法）。

g Cleandata映射到GMMC基因组的比例，与包括NCBI数据库中的参考微生物基因组（BFAP，包括细菌、真菌、古细菌和原生动物参考基因组）以及选定模式生物的MAGs在内的公共数据集进行比较。使用Wilcoxon Rank Sum test显示不同组之间的统计学显著性；**** 表示 P < 0.0001）。

GMMC的分类和功能注释

Taxonomic and functional annotation of the GMMC genomes

首先，我们使用GTDB-Tk对GMMC中的细菌和古细菌MAGs进行了分类学分类。在4,075个MAGs中，所有MAGs都能被分配到其各自的界（细菌，n = 4,004；古菌，n = 71），大多数MAGs能够在门、纲、目和科的层次上被分配到已知的分类（图2a、c）。然而，在种层面上，只有451个MAGs（11.07%）能够被分类为已知的物种（图2c），这表明大多数MAGs以前尚未被鉴定（即不在GTDB数据库中），与我们使用ANI的分析结果一致（图1f）。在门分类上，细菌MAGs主要由Firmicutes_A（n = 1,503）和Bacteroidota（n = 1,479）作为优势菌门，其次是Verrucomicrobiota、Proteobacteria和Spirochaetota。所有的Firmicutes_A中MAGs均来自于Clostridia纲，其中包括Oscillospirales目（n = 867）、4C28d-15目（n = 281）、Lachnospirales目（n = 236）和Lachnospiraceae科（n = 225）。所有的Bacteroidota中MAGs都属于Bacteroidia纲，其中包括Bacteroidales目（n = 1,474）和Flavobacteriales目（n = 5，仅含UBA1820科）。Verrucomicrobiota目的MAGs分为三类：Lentisphaeria（n = 180）、Verrucomicrobiae（n = 61）和Kiritimatiellae（n = 45）。所有的古细菌MAGs都是已知的产甲烷菌，属于Thermoplasmatota门（n = 37）、Halobacterota门（n = 30）和Euryarchaeota门（n = 4）。值得注意的是，在我们之前的水牛中研究发现，与Euryarchaeota门（n = 24）相比，Halobacterota门（n = 84）的数量更多。这表明，在反刍动物中，Halobacterota门相对于Euryarchaeota门具有更高的菌株多样性。值得一提的是，就相对丰度而言，我们发现Halobacterota 门包含的MAGs仅在48.89%的山羊样本中存在（243/497），而Euryarchaeota 门包含的MAGs则存在于90.34%的山羊样本中（449/497）。这进一步证实了甲烷产生菌门Methanobrevibacter在反刍动物中广泛存的重要分类观点。

最近的一项研究中，一个包括6只山羊在内的多个反刍动物肠道细菌/古细菌基因组目录（以下简称瘤胃基因组目录）已经构建完成。因此，我们将这个目录与我们的GMMC进行了详细的比较。总的来说，GMMC中约有56.37%（n = 2,297）的基因组与瘤胃基因组目录中的MAGs的ANI < 95%（图S3a；表S7）；其中，1,241个基因组属于Firmicutes门（Firmicutes和Firmicutes_A），主要来自Oscillospirales目（1,241个MAGs中的53.26%）、4C28d-15目（14.75%）和Lachnospirales目（14.18%）（图S3b）。值得注意的是，Oscillospirales和Lachnospirales目中的物种已知具有消化功能，而4C28d-15目已知在瘤胃中丰富存在。这些结果表明，我们的GMMC能够显著扩展已有数据库中具有重要功能的微生物分类。同时，我们使用VirusTaxo和Demovir工具对GMMC病毒基因组进行了注释。我们将其中的75.67%分配到已知的分类类群中（图2b，图S4）；其中，602个病毒被分配到Poxviridae科，其次是Mimiviridae（n = 573）、Microviridae（n = 477）和Siphoviridae（n = 120）。总体分类分布与其他来源于人类的宏基因组病毒目录（包括GVD、MGV和GPD）类似。

我们从所有的GMMC基因组中注释了7,645,971个蛋白编码基因，并使用CD-HIT在95%氨基酸相似性阈值下去冗余，得到了4,817,256个非冗余基因。稀疏性分析显示，基因数量在约150个样本处趋于平稳，这表明我们的样本足够恢复山羊肠道微生物基因组中的大部分基因；对于内容物和粪便样本，也存在类似的趋势（图S5a）。我们将这些基因的蛋白质序列查询到常用数据库中，并根据eggNOG和CAZyme数据库进行了注释，分别注释了其中的79.27%（其中58.09%被分配到已知功能）和4.02%。值得注意的是，20.70%（n = 997,417）的非冗余基因在公共蛋白质数据库中没有同源物，48.05%的基因在这两个数据库中都没有被分配到已知的功能，这意味着几乎一半的非冗余蛋白处于待发掘新功能的状态。

图2 GMMC的分类和功能注释

a GMMC中4,004个细菌MAGs和71个古细菌MAGs的系统发育关系以及根据GTDB-Tk进行的分类学分类。

b 7,204个病毒基因组的分类学注释，按病毒门进行颜色编码。内部和叶片支的星星表示VirusTaxo和Demovir未分类的等级。

c 细菌（右）和古菌（左）MAGs在GTDB中不同分类级别的注释率。

d、e、f 使用CAZymes（e）和eggNOG（f）数据库对非冗余蛋白进行的注释；韦恩图（d）显示了在eggNOG（绿色）和CAZyme（橙色）之间的蛋白编码基因的注释重叠部分；饼图显示了这两种方法注释的蛋白质的比例（左）和各自分类占比（右）。

山羊胃肠道中的微生物群落动态受饮食影响，与胃肠道位点的功能负担和疾病风险相关

Microbial community dynamics along goat GIT were driven by diet and associated with functional burdens and disease risks of GIT sites

我们接着评估了各因素影响山羊胃肠道微生物群落组成的大小，包括胃肠道位点、地理位置、宿主年龄和饲养方式。我们观察到胃肠道位点的影响最大，其次是地理位置、年龄和饲养方式，这些结果基于单因素和多因素的PERMANOVA（置换多元方差分析）（方法，P < 0.001；图3a）。我们在细菌/古细菌和病毒基因组上使用了单因素和多因素两种方法，结果趋势相似。

为了检查来自同一胃肠道部位（即胃、小肠、大肠和直肠即粪便样本）的样本是否具有类似的群落组成，我们对基于GMMC的相对丰度的样本间差异进行了非度量多维缩放（NMDS）分析（基于Bray-Curtis距离）。我们发现，样本在胃肠道位点上有显著的聚类（相似性分析（ANOSIM）；细菌/古细菌：R = 0.1867，P < 0.001；病毒：R = 0.0167，P < 0.002；图3b）。如图3b所示，大肠和直肠的样本聚集在一起，并与胃部样本分开，这是符合预期的。这些结果表明了不同胃肠道部位的独特微生物组成。

然后，我们更详细地研究了沿着山羊胃肠道的微生物动态变化。总体而言，Firmicutes_all（即Firmicutes、Firmicutes_A、Firmicutes_B和Firmicutes_C的组合，也称为Bacillota）和Bacteroidota是最丰富的两个门，分别占总相对丰度的51.27%和25.82%（图3c）。尽管微生物组成在样本间存在显著变化，我们观察到胃样本的Firmicutes_all与Bacteroidota比例（F/B比率）在胃部样本中保持基本稳定，在四个胃室内部和之间是可比较的（图3c）。F/B比率在小肠（空肠）内部开始显示明显的波动，并进一步延伸到下游胃肠道位点（图3c）。为了探索其中的影响变化，我们对沿着山羊胃肠道的F/B比率动态进行了聚类分析，并使用了来自九个胃肠道位点中至少有七个样本的23只山羊的样本。聚类1在胃和大肠中显示了相对较低且的F/B比率，在小肠部位，尤其是空肠和回肠中，出现了突然的高峰。相反，聚类2在沿着山羊胃肠道逐渐增加F/B比率（图3d）。我们比较了这两组羊的饮食，发现聚类1中的大多数羊喂食青贮饲料即圈养饲养，而聚类2中的大多数羊喂食草料（图3d和S6）即放养饲养。先前的研究表明，Firmicutes_all和Bacteroidota物种代表了消化能力和吸收能力，因此F/B比率动态表明不同胃肠道位点的消化/吸收负担不同，在这种情况下，发酵的青贮饲料在小肠中被提前吸收，而草料逐渐沿着山羊的肠道被吸收。因此，我们的结果与青贮饲料更容易消化，只有少数胃肠道位点参与了消化过程（因此F/B比率较高），而草料更难消化，需要更多的胃肠道位点参与消化的事实一致。

山羊胃肠道沿着F/B比率的这两种趋势也与独特的疾病风险相关。我们比较了两组羊在胃肠道位点上不同属的相对丰度，并发现在聚类1中的空肠处，Odoribacter和Campylobacter的相对丰度显著增加（图3e）。Campylobacter是引起肠炎的典型属，表明疾病风险增加。相反，已经表明Odoribacter能够有效地抑制肠道炎症，这表明山羊空肠消化位点的微生物群落具有抵抗肠道炎症的潜力。

图3 山羊胃肠道微生物群落动态变化及饮食影响

a 多因素对整体微生物群落组成的贡献，由细菌和古菌（左）以及病毒（右）的多因素分析结果决定。水平条代表每个已识别协变量解释的推测方差量（调整后的R2）。所有因素都与肠道微生物变异显著相关（P = 0.001）

b 基于样本间Bray-Curtis差异的非度量多维缩放（NMDS）分析显示了来自四个山羊胃肠道部位的样本之间的关系

c 山羊样本中整体Firmicutes_all / Bacteroidota（F/B）比率（上部）以及按照胃肠道位点和部位分组的门水平详细相对丰度（下部）

d 聚类分析揭示的沿着胃肠道位点的F/B比率趋势以及饲喂方式的影响；每条线代表一只山羊，其从九个胃肠道位点中至少有七个胃肠道位点样本，按不同的饲喂类型进行分组（绿色：草料饲喂-放养，黄色：青贮饲喂-圈养），红线表示推断的趋势，饼图显示了对应聚类中山羊的饮食组成比例

e 两聚类中属的相对丰度与山羊胃肠道位点的关系。相对丰度是以每百万测序干净读序的计数计算的（TPM，log10转换；方法）。Wilcoxon Rank Sum检验用于显示组间的统计学显著性。ns：无显著性，* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.0001，**** P < 0.0001。

山羊胃肠道微生物类群的分布和变化

Distribution and variation of microbial taxa along the goat GIT

然后我们更详细地探究了山羊胃肠道中已有物种注释的微生物类群的分布和相对丰度变化，特别是那些在甲烷产生和纤维素消化方面具有已知功能的类群。我们总共鉴定出了311个在四个胃肠道部位之间显示显著丰度变化的属（双组Wilcoxon秩和检验，p < 0.05）。其中，所有四个甲烷产生相关属的分布差异明显，包括Methanomethylophilus、Methanocorpusculum、Methanobrevibacter_A和ISO4-G1（图4a）。有趣的是，Methanomethylophilus是唯一一个在胃组相对丰度最高的属，而其他属在胃（最低）到直肠（最高）的分布中（Methanocorpusculum），或者在胃肠道中分布变化（Methanobrevibacter_A和ISO4-G1）（图4a；另见图S7）。这些结果表明，除了胃之外的胃肠道部位也参与了甲烷的生产，与我们之前在水牛胃肠道微生物群落中的观察一致。

我们还观察到注释的纤维素消化细菌在胃肠道部位之间存在显著变化，包括六个属：Prevotella、Fibrobacter、Faecalibacterium、Acetivibrio_A、Ruminiclostridium_E和Paraprevotella。前两个属，即Prevotella和Fibrobacter在胃和小肠中的相对丰度较高，而其他四个属在下游部位（即大肠和直肠）中的丰度较高（图4a和图S7）。这些功能性细菌属反映了山羊宿主与微生物之间的相互作用趋势，在不同的胃肠道部位共同促进消化和吸收功能。例如，已有报道称Prevotella物种在纤维素消化中发挥了重要作用，并参与了牛瘤胃中淀粉、纤维素、半纤维素和果胶的转化，而Fibrobacter物种则与Prevotella物种一起参与纤维素消化。

由于纤维素消化能力对山羊的发育和品质至关重要，我们接下来着重识别具有潜在纤维素消化功能的新属。我们将涉及葡萄糖苷水解酶（GHs与纤维素消化相关）的CZAyme属的相对丰度与各个属的丰度进行了相关分析。结果鉴定出了185个属（在311个差异属中），其丰度与至少一个GHs类别呈显著正相关（Pearson相关系数R≥0.5，P<0.05）。我们发现其中有26.5%（49个属）被报道具有纤维素消化能力，都在GMMC中被找到（详见表S7），支持了我们方法的有效性；剩余的136个属中（在185个中的73.5%）值得进一步研究。令人惊讶的是，这些属中的65.95%在大肠和直肠的部位具有更高的相对丰度（大肠组的15.68%，直肠组的50.27%），而仅有28.65%在胃中具有更高的相对丰度，这支持了下游胃肠道部位（即大肠和直肠组）在纤维素消化中的重要作用的观点。后续非常值得进一步的工作来实验验证这些属的能力和它们的底物特异性。

图4 山羊胃肠道中重要功能属的分布和变化

a 山羊胃肠道中甲烷产生属（黄色）和纤维素消化属（绿色）的相对丰度变化（TPM，以10的对数形式转换；详见材料和方法）。它们的差异分布是通过使用LEfSe进行组间识别的（详见材料和方法）；Wilcoxon秩和检验用于显示组间的统计学显著性。ns：无显著性，* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.0001，**** P <0.0001。

b参与纤维素消化的CZAyme类别在不同胃肠道部位中呈显著正相关的属。热图的颜色表示相关系数（r）；显著的正相关结果具有r≥0.5，且P<0.05。饼图显示了这些属在其中显示最高相对丰度和GHs分类的胃肠道部位。* 表示之前未被注释为具有纤维素消化能力的属（新发现的具有消化纤维素潜力的属）。

年龄、饲养方式和地理因素影响的山羊胃肠道微生物的变化

Variation of goat GIT microbiota associated with age, feeding style and geography

除了胃肠道部位以外，其他因素也显著影响了山羊胃肠道微生物群的整体组成，例如年龄、饲养方式和地理因素（图3a）。例如，在NMDS分析中，我们观察到粪便样本显著各自聚集（图5a、b、c），包括发育阶段（1月龄、6月龄和12月龄；表S3）、饲养方式（圈养和放养；表S4）和地理位置（中国云南、四川、广西和海南省；表S5）；细菌/古细菌和病毒基因组均呈现类似的趋势（图5a、b、c），并与多因素PERMANOVA分析结果一致（图3a）。

因此，我们还进一步探究了这些因素对微生物群的影响。我们在图中标示了350个细菌/古细菌属，这些属在至少一个组间比较中显示出显著的丰度差异，其中有201个、99个、114个属分别可归因于年龄、饲养方式和地理位置（图5d）。有趣的是，这些属之间存在显著的重叠（54个属在所有四个因素中显示出显著的相对丰度差异）。例如，与饲养方式相关的属几乎是年龄相关属的一个子集，而它们都与与地理位置相关的属显著重叠（图5d）。实际上，这些结果是符合预期的，因为这三个因素都与膳食结构的差异有关。例如，6月龄以上的山羊会从富含乳制品的饮食切换到富含纤维的饮食，这会导致甲烷产生菌和纤维素消化物种显著增加（图5e）；这对胃肠道微生物群的影响就像放养（富含草料的饮食）和圈养（富含青贮料的饮食）类型之间的影响一样（图5e）。因此，我们推测，这些重叠的属与山羊的核心特征（如食物消化和养分吸收效率以及甲烷排放）相关，具有普遍重要性。同时，那些与特定年龄相关的属，可能在山羊发育过程中发挥重要作用。

图5 山羊胃肠道微生物群落在年龄、饲养方式和地理因素的变化

a、b、c基于Bray-Curtis差异（方法，子集（在表S1中表示为行262-499的样本））的NMDS显示样本按山羊年龄（a）、饲养方式（b）和地理位置（c）显著聚集

d Venn图和upset图显示了在不同因素（包括年龄、饲养方式、地理位置和胃肠道部位）之间差异相对丰度属的共有和特有关系，图中显示的属是在至少一个因素中存在差异的属

e 与不同年龄、饲养方式和地理分布相关的甲烷产生和纤维素消化相关属的差异。黄色和绿色分别表示甲烷产生和纤维素消化相关的属。差异性属在两组之间使用线性判别分析效果大小（LEfSe）分析（方法）中被鉴定出（方法）；使用Wilcoxon秩和检验检验组间的统计学显著性。ns：无显著性，* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.0001，**** P <0.0001。

GMMC的病毒组宿主预测和针对甲烷产生菌的溶菌性病毒的鉴定

Host prediction of the GMMC virome and identification lytic viruses targeting methane-producers

由于大多数病毒在物种层面上具有宿主，它们是精确操纵山羊胃肠道细菌和古细菌的理想工具。因此，我们还使用多种不同的方法对GMMC中的病毒进行了宿主预测，包括CRISPR-spacer和基于同源性的方法，VirHostMacher工具，以及基于分箱的方法。总共有4,202个病毒基因组（占总数的58.3%）至少可以通过其中一种方法分配给它们的细菌/古细菌宿主（即GMMC中的MAGs）。我们观察到在病毒-宿主关系方面，这些方法之间几乎没有重叠，与先前的结果一致。总体而言，只有5.7%的病毒-宿主关系受到两种或更多方法的支持（图6a）。在所有有预测宿主的病毒中，有1,321个（占有预测宿主的4,202个病毒的31%）被预测只有一个宿主，可以归类为特异性寄生病毒（图6b），而其他病毒则与两个或多宿主有关，被归类为广义寄生病毒。在GMMC中，有1,216个属于Bacteroidota的MAGs被预测为GMMC病毒的宿主，其次是Firmicutes_A（n = 871），Proteobacteria（n = 248）和Verrucomicrobiota（n = 229）。在属水平上，最常见的宿主是Prevotella（n = 552），其次是Alistipes（n = 500），RF16（n = 480），F082（n = 334）和Akkermansia（n = 196）。许多功能重要的属被这些病毒所攻击，包括Prevotella（纤维素消化属），Alistipes，Akkermansia（宿主免疫功能）和RF16（食物消化），这表明它们在山羊胃肠道微生物结构和功能中具有重要的调控作用。

病毒是潜在的抑制产甲烷菌生长的理想工具，然而，到目前为止，只有少数几种甲烷产生菌病毒被鉴定出来。因此，我们筛选了GMMC中所有的病毒，并鉴定出共有104个病毒靶向作用于甲烷产生菌（图6d）。根据DeePhage工具的结果，其中68个病毒被认为是溶菌性的（具有毒力或毒力不确定），可以靶向本研究中鉴定的所有四个甲烷产生菌属。此外，有五种病毒-宿主关系受到两种或更多方法的支持，包括四种溶菌性病毒与三种甲烷产生菌的作用关系（图6d）。这些结果为今后针对这些病毒的有针对性的分离和其对甲烷产生菌毒力的实验验证提供了支持。

图6 GMMC中病毒组宿主预测和靶向甲烷产生菌的溶菌性病毒鉴定

a 四种不同方法预测病毒-宿主相互作用结果。大小表示病毒-宿主相互作用数量。饼图显示能够通过这些方法预测其宿主的病毒基因组比例

b 病毒根据其预测宿主数量的分布。病毒可以分为特异性寄生病毒（宿主数量=1）和广义寄生病毒（宿主数量>1）

c 病毒根据其宿主的分类分布和特征，包括基因组大小、注释率、宿主特异性和生活方式。生活方式是使用DeePhage进行预测，并分为两组（毒力性：得分>=50，温和性：得分<50）

d 病毒与甲烷产生菌（即古细菌）之间的相互作用网络。实线和红色虚线分别表示由一种方法和两种方法预测的连接。

- 讨论 -

山羊是重要的反刍动物，在山羊胃肠道（GIT）中的微生物群落已被证实在消化、吸收等方面发挥重要作用。尽管近年来微生物组研究取得了显著进展，但对山羊微生物组包括GIT部位、发育阶段、饲养方式和地理因素等的全面研究，仍然不完整。在本研究中，我们收集的样本包括497个样本，涵盖了十个GIT部位、三个发育阶段、两种饲养方式和四个地理位置。基于这个样本数据集，我们构建了山羊肠道微生物基因组目录（GMMC），包括4,004个细菌、71个古细菌和7,204个病毒基因组，并对总共4,817,256个非冗余的编码蛋白基因进行了功能注释。与最近的两个山羊微生物组数据集相比（图1g），GMMC基因组含有显著比例的新基因，且显著增加了公共数据集上的山羊微生物组测序读序的覆盖范围（图1e）。

除了数据的新颖性外，我们对GMMC数据的分析还揭示了一种沿着山羊GIT的饮食驱动的微生物群落动态模式，与山羊肠道食物消化、吸收能力和疾病风险相关（图3d、e，图S6）。此外，我们还发现，年龄、饲养方式和地理等因素也对肠道微生物组产生显著影响，但大多数受影响的微生物类群直接或间接与饲养方式相关（图5d），特别是与甲烷产生和纤维素消化相关的类群。因此，我们推测，这些重叠的类群与山羊的核心特征，如食物消化和营养吸收效率以及甲烷排放有关，具有普遍重要性，而与年龄等特定因素相关的类群，在山羊发育过程中扮演重要角色。鉴于肠道微生物在反刍动物中的重要性，我们推测在所有这些动物中都会发现类似的模式。

最后，我们在GMMC目录中挖掘出68种针对所有四个古菌属的甲烷产生菌的溶菌性病毒（图6d，表S8）。以往的研究表明，针对甲烷产生菌的病毒可以用于减少甲烷排放，但目前缺乏大规模识别此类病毒的方法。因此，我们的结果提供了一种可行的方法的参考基因组，并鼓励研究人员挖掘类似的资源，用于其他重要的反刍动物，包括水牛和牛等反刍动物。

尽管有上述进展，我们要承认我们的数据集存在局限性，主要是由于所使用的mNGS平台的读长相对较短。近期的研究已经展示了长读长测序平台（如PacBio和Nanopore）在组装质量和获得更高比例完整MAGs方面的显著改进，正如在鸡和人的研究中所展示的。尽管我们的研究取得了相当比例的高质量MAGs（47%），但通过利用第三代测序平台提供的能力，还有进一步的提升潜力。

综上所述，我们对GMMC目录的组装和分析为山羊GIT微生物组提供了功能性研究，这些研究有可能适用于其他反刍动物，并为改善山羊和保护生态环境的质量铺平了道路。

参考文献

Cao, Y., Feng, T., Wu, Y. et al. The multi-kingdom microbiome of the goat gastrointestinal tract. Microbiome 11, 219 (2023). https://doi.org/10.1186/s40168-023-01651-6

- 作者简介 -

佛山科学技术学院生命科学与工程学院刘庆友教授与华中科技大学生命科学与技术学院陈卫华教授为本文的共同通讯作者。广西农业职业技术大学曹艳红博士、华中科技大学生命科学与技术学院博士生冯彤与华中科技大学生命科学与技术学院博士生吴英健为本文的共同第一作者。

通讯作者

佛山科学技术学院

刘庆友

教授

刘庆友，佛山科学技术学院，教授，博士生导师，动物科学专业负责人。入选广西高校卓越学者，中组部“西部之光”访问学者计划，兼任第四届国家畜禽遗传资源委员会牛专业委员会委员、第五届全国畜牧学科高峰论坛副秘书长、中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会理事、国家农业基因组科技创新联盟理事、中国农业生物技术学会动物生物技术分会理事，广东省畜禽遗传资源委员会委员，广西区畜禽遗传资源委员会委员。兼任《Fronters in genetics》编委、《基因组学与应用生物学》副主编、皇氏赛尔生物科技（广西）有限公司育种总监。近年来在多组学联合解析畜禽重要经济性状的调控机制研究中，有所进展。以主要作者（通讯或第一）身份在在Nature Communications, National Science Review, Microbiome, Molecular Biology and Evolution, Gagascience, Journal of Dairy Science, Journal Of Nanobiotechnology等期刊发表论文70余篇篇，入选ESI全球TOP 1%高被引论文1篇。

华中科技大学

陈卫华

教授

陈卫华，华中科技大学教授、博士生导师；国家海外高层次青年人才。长期致力于菌群精细调控与健康研究。通过实验与生物信息学分析相结合，系统发现疾病、健康相关微生物；利用噬菌体或小分子物质对特定细菌精准调控，以达到改善微生态、干预和治疗疾病之目的。以主要作者（通讯或第一）身份在Science、Gut、Cell Metabolism、Nature Communications、Genome Biology、Microbiome、Molecular Systems Biology、Advanced Science、Nucleic Acids Research等杂志发表文章70多篇。引用6000多次，H-因子32。

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