研究者采用53抗体CODEX多重成像，对78例HNSCC患者的配对原发肿瘤和淋巴结样本开展空间蛋白分析，其中49例初诊存在淋巴结病变，29例无淋巴结受累。研究共分析390个组织芯和1,556,233个细胞，识别21类主要细胞，并结合空间转录组、独立患者队列、健康对照以及B16-F0小鼠淋巴结转移模型。淋巴结同时包含滤泡、滤泡周围T细胞区、髓系细胞和基质网络，细胞比例相近的样本也可能形成不同的空间组

PCF（CODEX）空间蛋白组通过多轮成像在同一切片检测多个蛋白，既支持肿瘤、T细胞、浆细胞、髓系细胞与基质成分分型，也保留细胞邻接和组织区室。分析应报告区域定义和邻域参数，并用不同参数检查稳定性。围绕空间指标与转化验证，研究将TLS1频率及CD31高、CD38高浆细胞特征与挽救性手术后的复发进行关联分析，但队列仅9例，属于探索性证据，需要谨慎解释。作者还区分TLS1和TLS2：TLS1以浆细胞及

围绕冷冻组织的多重成像流程，研究对OCT包埋新鲜冷冻组织进行5微米切片，使用30抗体CODEX panel和12轮成像，覆盖121个相邻视野，并对图像质量、分割和荧光信号进行复核。PCF（CODEX）空间单细胞蛋白组通过多轮成像在同一切片检测多个蛋白，既支持肿瘤、T细胞、浆细胞、髓系细胞与基质成分分型，也保留细胞邻接和组织区室。研究对OCT包埋新鲜冷冻组织进行5微米切片，使用30抗体CODEX p

论文实际完成的是FFPE-CODEX、细胞分型、邻域组织、功能状态和邻域间通信分析；PCF（CODEX）空间蛋白组在同一FFPE切片上同步检测肿瘤、免疫、基质和血管相关蛋白，支持细胞分型、功能状态、邻域组成和邻域通信分析。本研究将抗体验证、迭代成像、细胞分割、X-shift聚类、Voronoi可视化和空间统计结合，并回到原始图像核查细胞簇与邻域。围绕FFPE-CODEX的技术可行性，研究重新优化C

对于跨批次数据，可设置相同组织来源的桥接切片，监测信号漂移、细胞分型稳定性和空间指标重复性，并保留审计记录。作者还区分TLS1和TLS2：TLS1以浆细胞及多类效应免疫细胞为主要特征，TLS2则包含M2样巨噬细胞、Treg、PMN-MDSC、基质、血管及效应细胞。PCF（CODEX）空间蛋白组通过多轮成像在同一切片检测多个蛋白，既支持肿瘤、T细胞、浆细胞、髓系细胞与基质成分分型，也保留细胞邻接和组

研究共分析390个组织芯和1,556,233个细胞，识别21类主要细胞，并结合空间转录组、独立患者队列、健康对照以及B16-F0小鼠淋巴结转移模型。拓展研究可考虑：可先由空间转录组筛选区域通路和配体-受体线索，再用PCF在相邻切片上验证对应蛋白、细胞来源及其空间交叠。这也是PCF（CODEX）空间蛋白组在头颈鳞状细胞癌研究中的重要用途：不仅统计细胞数量，还保留细胞所在区室、邻近对象和局部组织结构。

通过CELESTA算法进行细胞分型后，研究不仅确认了BST肿瘤上皮（TROP2+）和BIT肿瘤上皮（CHI3L1+TAGLN+）两种不同状态的空间分布，还定量分析了它们与周围髓系细胞、成纤维细胞、T细胞等的空间邻域关系。对于复杂组织微环境研究而言，PCF（CODEX）所代表的超多重蛋白成像技术有助于补充空间转录组难以直接呈现的蛋白层信息，使研究者能够从转录地图走向组织原位的蛋白功能观察。需要强调的

然而，传统的单细胞转录组学（scRNA-seq）在解析这一过程时存在天然的“战略缺失”：组织解离过程彻底抹去了细胞在微环境中的空间坐标，而这种“位置信息”恰恰是决定成纤维细胞激活、转化及其与免疫生态位互作的深层逻辑。）空间蛋白组技术，将单细胞测序的分子蓝图转化为原位生物学事实，精准捕捉蛋白质表达及其空间邻域关系，从而识别出纤维化高峰（第12天）主导基质沉积的核心细胞亚群，以及重塑期（第21/28天

空间转录组的优势在于能够在组织切片中定位基因表达的空间分布，帮助研究者识别不同组织区域的转录特征。二者不是重复检测，而是从转录层和蛋白层共同构建空间组学证据链，有助于将空间表达线索转化为更具体的机制假设，为后续研究提供组织层观察维度。巨噬细胞和Treg细胞特征基因的空间重叠信号，但仅凭转录信息难以进一步区分这些细胞在蛋白层面的具体表型，也难以精确量化它们之间的空间邻近关系。所代表的单细胞组织原位空

空间转录组可以提示APOE+/CD163+巨噬细胞与EMT样肿瘤区域在组织中的共现，而22-plex PCF(CODEX)进一步把Melan-A标记的肿瘤细胞、CD68/CD163/APOE标记的巨噬细胞、E-cadherin/N-cadherin相关EMT状态、IGF1/IGF1R表达以及T细胞、B细胞、树突细胞等免疫成分放在同一张组织切片中观察。尤其在肿瘤微环境研究中，许多关键问题都发生在蛋白