1.实验设计考虑

生物体中总RNA=（～90%）rRNA+ （1～2%）mRNA+（8～9%）其他RNA

对于真核生物，可通过 oligo dT磁珠富集mRNA来进行建库
而如果想研究lncRNA、全转录组或原核生物转录组，可以通过去除rRNA的方法进行建库

建库另一个要考虑的方面：
链特异性与非特异性（stranded or un-stranded）

2.建库过程

本文以Illumina的NEBNext方法介绍建库详细过程与原理，
本文库有两个特点：oligo dT富集与非链特异性

建库流程如下：

图一：

1）总RNA提取

提取后的总RNA要进行纯度(purity)、浓度(quantity)、完整性(RIN)的质量检查。

不同样品的total RNA中mRNA含量差异较大，若total RNA起始投入量过低，不能保证有足够的mRNA用于后续建库，因此建议RNA起始量为1～4μg。

不同RIN（RNA intergrity number）示意图：（从1～10为bad to good）

图二：

由于不完整或降解的total RNA会在测序时产生3‘偏好性，因此建议RIN值≥7。

2）mRNA分离与片段化

分离：因为真核生物成熟mRNA有ploy（A）尾，而其他RNA没有，所以可以用oligo dT磁珠与mRNA的poly（A）尾特异性结合从而去除其他RNA。
片段化：用试剂（fragmentation reagent）将纯化的mRNA片段化

图三：

如图（A、B、C、D）所示，实际上，无论哪种建库方式，都会无法避免地测到基因组DNA、pre-mRNA、rRNA和其他RNA。

3）cDNA第一链合成

随机六聚体引物（random hexamer primer），逆转录酶以mRNA为模版合成cDNA

4）cDNA第二链合成

第二链合成并删除mRNA，产生双链cDNA（ds cDNA）。
纯化双链cDNA

5）双链cDNA的末端修复

末端补齐，再纯化修复后的cDNA。ds cDNA3‘端加A（dA - tailing）。

6） 连接接头

每个接头都有一个index（6bp），不同的文库构建可以使用不同的index。
可以这么理解：我有很多个样品，每个样品用不同index接头建库，这些文库可以混在一起（混之前要归一化）拿去同一个lane中测序，再根据index区分出来。

然后纯化连接了接头的 ds cDNA

7）PCR富集文库

如图一，PCR扩增时所用的引物上有P5、P7引物和 barcode？
此时的barcode有什么用不太记得了～，等下周理测序原理再回来补。

扩增完纯化后，进行文库质检，质检完的文库就可以拿去上机测序了。

参考文献：
1.RNA sequencing: the teenage years
2.A survey of best practices for RNA-seq dataanalysis
3.Informatics for RNA Sequencing: A Web Resource for Analysis on the Cloud

The End

怀念那些无所事事一整个夏天的年少